食品种类很多,食品中pro 的性质和含量各不相同,而且其他成分,如碳水化合物,脂肪和维生素的干扰成分很多,因此pro 的测定通常利用经典的凯氏定氮法将样品消化成铵盐蒸馏,用标准酸液吸收,用标准酸或碱液滴定,由样品中含氮量计算出pro 的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它们的基本原理都是一样的。我们在检验食品中pro 时,往往只限于测定总氮量,然后乘以pro 核算等数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗pro 。

不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的,首先第一个步骤是消化:样品与硫酸一起加热消化,硫酸使有机物脱水。并破坏有机物,使有机物中的C、H 氧化为CO2 和H2O 蒸汽逸出,而pro 则分解氮,则与硫酸结合成硫酸铵,留在酸性溶液中。在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解,它与硫酸反应生成硫酸氢钾,可提高反应温度,一般纯硫酸加热沸点330 ℃,而添加硫酸钾后,温度可达400 ℃,加速了整个反应过程。此外,也可以加入硫酸钠,氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解,水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大,沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大,否则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨而造成损失。

为了加速反应过程,还加入硫酸铜,氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢,次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后,出现硫酸铜的兰绿色,它具有催化功能,还可以作为碱性反应指示剂。使用仪器推荐：消化炉或者全自动定氮仪。

1.1 　蒸馏

样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨,在这操作中,一是加入氢氧化钠溶液要过量,二是要防止样液中氨气逸出。吸收与滴定:蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收,然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液,从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用标准盐酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影响指示剂变色反应,它有吸收氨的作用。

1.2 　操作步骤

准确称取样品中(0.50～2.00) g →于500ml 凯氏瓶中→加10g 无水K2SO4 →加0.5gCuSO4 →加20mlH2SO4 →在通风橱中先以小火加热,待泡沫消失后,加大火力,消化至透明无黑粒后,将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30 分钟→至到样液呈绿色状态,停止消化,冷却→加200ml 水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K 氏瓶中加波动珠数粒和80ml50 %NaOH →立即接好定氮球→加热→至到K氏瓶内残液减少到三分之一时,取出用水冲洗→用0.1N HCl 滴定。

计算:总氮量% = ( N ( V2 - V1) ×0.014) / W ×100

0.014 ———氮的毫克当量数

pro % = 总氮% ×K

乳制品K = 6.38 ( N = 15.7 %)

小麦粉K = 5.79 ( N = 17.6 %)

动物胶K = 5.6 ( N = 18.0 %)

冰蛋K = 6.7 ( N = 14.8 %)

大豆制品K = 6.0 ( 16.7 %) 　K = 6.25 则( N =16 %)

K - 换称等数

1.3 　各种试剂的作用

浓H2SO4 : (1) 脱水使有机物炭化,然后有机物炭化生成碳,碳将H2SO4 还原为SO2 ,本身则变为CO2 。(2)氧化。(3) pro 与浓H2SO4 生成NH3 ↑,CO2 , SO2 , H2O↑。(4) NH3 与H2SO4 生成硫酸铵。

CuSO4 :催化剂,CuSO4 为红色沉淀,当C 完全消化后,反应停止,红色消失,变为兰色,即为消化达到完全,兰色为CuSO4 的颜色。K2SO4 :提高沸点,沸点由330 ℃提高到400 ℃加速了反应过程。

下面就几方面来说明影响氨化完全与否和速度快慢的因素:

(1) K氏烧瓶和取样量

如果称1g 以上的样品, 就需要K 氏烧瓶最小500ml , (800～1000) ml 的更好,这样的K 氏烧瓶对于缩短氨化时间,加热的均匀性和完全氨化效果最好。

(2) 分解剂

H2SO4 和K2SO4 的添加量。有机无分解需要H2SO4 量,H2SO4 应根据有机物种类不同而加的量就不同,如果试样含脂类高,则加H2SO4 多,为了提高分解温度,要大量添加K2SO4 ,但不能太多,也不能太少,太少则氨化不充分。K2SO4 和H2SO4 的添加比例是:1g 样品　K2SO4 : H2SO4 = 7g :12ml这种比例在国内外都使用,是公认的还有一种比例: K2SO4 :H2SO4 = 10 :20ml

(3) 催化剂

用作催化剂的有Hg、HgO、Se , 硒化合物, CuSO4 、TiO2 ,对Hg ,HgO 有毒但结果好,Se 与CuSO4 得到结果是一种,TiO2 ,的结果偏低,采用不同的催化剂则消化时间不同, HgO 消化麦子为38 ,Se 与CuSO4 消化麦子55 ,TiO2 消化麦子70 ,所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。

(4) 热源的强度

消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大,即便盐类K2SO4 加得多,如果热源弱,也是没有意义的,热源过强导致H2SO4 损失,使氨回收率低,另外K氏瓶的容量大小,颈部的粗细和长短等,也与热源的强度有关。

(5) 氨的蒸馏和吸收及滴定

蒸馏有两种:直接蒸馏(装置简便,准确性好) 和水蒸汽蒸馏。蒸馏加NaOH 是50 % ,加的量为H2SO4 量的4倍,硫酸量为12ml ,则NaOH 为12 ×4 = 48ml ,而且一般高于这个理论值,即加到(50～55) ml ,如果NaOH 量加的不够就变成H2S , H2S 是强酸,使颜色变红。吸收液有:标准H2SO4 ,用标准碱返滴定,甲醛红指示剂;硼酸,用HCl 进行滴定,混合指示剂。目前都用硼酸吸收液,用硼酸代替H2SO4 ,这样可省略了反滴定, H2SO4 是强酸,要求较严,而硼酸是弱酸,在滴定时,不影响指示剂变色范围,另外硼酸为吸收液浓度在3 %以上可将氨完全吸收,为保险期间一般用4 %。

1.4 　实验注意事项

(1) 样品应是均匀的,若是固体样品应事先研细,液体样要混合均匀。

(2) 样品放入K氏烧瓶时,不要黏附瓶颈上,万一黏附可用少量水缓慢冲下,以免被检样消化不完全,使结果偏低。

(3) 消化时,如不容易呈透明溶液,可将K氏烧瓶放冷后,加入30 %过氧化氢催化剂(2～3) ml ,促使氧化。

(4) 在整个消化过程中,不要用强火,保持和缓的沸腾,使火力集中在K 氏烧瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。

(5) 如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这时会形成硫酸氢钾,而不与氨作用,因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时,要添加硫酸量。

(6) 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色,如果没有溴甲酚绿,可单独使用011 %甲醛红乙醇溶液。

(7) 氨是否完全蒸馏出来,pH 试纸检查馏出液是否为碱性。

(8) 向蒸馏瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀,有时Cu 离子与氨作用生成深兰色的络合物。

(9) 消化剂绿色后继续消化30min 即可。

二者原理相同,操作方法大同小异,半微量法消化后,定容100ml ,然后吸25ml 蒸馏吸收液吸收。计算总氮% = ( N ( V 2 - V 1 ) ×01014) / ( W ×10/100) ×100

对于微量定氮仪法,仪器有了改进,样液称样少,蒸馏消化液也少,其它基本一样。

原理与上面一样,仪器,采用凯氏定氮仪其装置内具有自动加碱蒸馏装置,自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置,消化装置:由优质玻璃制成的K 氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。