蛋白质是人类营养三要素之一,它是人体内一切组织的基本组成,它在生命现象和生命过程中起着决定性的作用。因此说蛋白质是维持生命所不可缺少的物质。人体不能合成蛋白质,只能从食物中摄取,而食物中的蛋白质则是人体获取蛋白质的一个重要来源。因此通过测定食品中粗蛋白质含量的多少,可以评价食品的营养价值,为合理利用食品资源,科学安排人民群众的膳食结构提供科学依据。

目前,食品中粗蛋白质的测定,是采用GB/ T500915- 2003《食品中蛋白质测定》标准中第一法:凯氏微量定氮法作为基本方法的。凯氏定氮法使用到的仪器有全自动凯氏定氮仪或者简称为蛋白质测定仪。蛋白质是由多种氨基酸组成的天然高聚物,而氨基酸则是由羧酸分子中烃基上的一个或几个氢原子被氨基取代后所生成的化合物,为一类含氮的有机化合物,同种食品中的蛋白质,其所含各种氨基酸的组成及种类有一个固定的比例,不同种的食品中其蛋白质所含各种氨基酸的比例略有不同。总的来说,食品中的蛋白质的含氮量约在15 - 19 % ,其中小麦中的蛋白质含氮量较高,约为1715 %左右,而其它谷物及豆类中蛋白质的含氮量约为16 %左右,根据此含氮百分比,通过测定食品中的含氮量即可换算出蛋白质的百分含量。

凯氏微量定氮法就是通过测定试样中的氮的含量,然后换算成蛋白质的含量。凯氏微量定氮法试验原理为:将粉碎的试样在硫酸钾─硫酸铜混合物的催化作用下中,加入硫酸加热消化,其中所含的蛋白质与硫酸反应,蛋白质的主要成份碳、氢、氧分别生成了二氧化碳、水等,而蛋白质中氨基酸中的氨基─NH2 则由于不易被氧化而得到一个氢原子生成氨(NH3 ) ,氨与过量的硫酸反应生成铵盐即硫酸铵[ (NH4) 2SO4 ] ,在消化后所得到的含硫酸铵的消化液里加入过量的碱,使溶液呈碱性,通过加热使硫酸铵分解生成氨并被蒸馏出来,然后用硼酸吸收蒸馏出来的氨,生成四硼酸氢铵(NH4HB4O7 ) ,最后用酸标准溶液中和其中的氨,从而定量的计算出氨的含量,最后换算成蛋白质的含量。因为在食品中,除蛋白质外,还含有其它有机含氮化合物,其中所含的氮在硫酸的作用下,也有一部分能反应生成氨,所以此方法测得的氮的含量,包括了非蛋白质中有机含氮化合物中的氮,所以用此法测得的蛋白质的结果,不是纯蛋白质的结果,而称之为粗蛋白质的结果。如需测定纯蛋白质的含量,则需将试样中非蛋白质的有机含氮化合物分离出去,然后再采用凯氏微量定氮法进行测定。得到的结果即是纯蛋白质的结果。总的来说,凯氏微量定氮法包括三个过程:消化、蒸馏、滴定。其各过程的主要反应如下:

蛋白质测定之消化:

RCHNH2COOH + H2SO4 →H2O + CO2 ↑+ SO2 ↑+(NH4) 2SO4

RCHNH2COOH 为蛋白质中氨基酸的结构通式,其中R 为烃基。

蛋白质测定之蒸馏:

(NH4) 2SO4 + NaOH →NH3 ↑+ Na2SO4NH3 + H3BO3 →NH4HB4O7

蛋白质测定之滴定:

NH4HB4O7 + HCl →NH4Cl + H3BO3

应用凯氏微量定氮法测定粗蛋白质试样用量少,反应复杂,如操作条件掌握不好;试验结果的重现性比较差。通过多年应用凯氏微量定氮法测定粗蛋白质的实践,总结出影响粗蛋白质测定的因素有以下几点:

1 　称样量

测定粗蛋白质时要注意试样的称样量不能太大,尤其是对蛋白质含量较高的试样,如大豆等。如果称样量大: ①消化时间长,硫酸的消耗量大,也容易造成消化不完全,蛋白质中的氮不能完全转化为氨,可导致测定结果偏低; ②消化时比较激烈,泡沫较多,也易导致消化不完全。所以称样是应根据蛋白质含量的大约范围,按含粗蛋白质不超过30 毫克来计算试样称用量。

2 　试样的消化过程对粗蛋白质测定结果的影响

试样的消化是影响粗蛋白质测定结果的一个重要因素,由于消化时试样少,温度高,反应激烈,消化条件如掌握不好也容易引起消化时间增长,消化不完全,或造成试样中的部分氮损失等。以笔者多年实践经验,样品消化时要注意以下几个方面: ①试样中加入硫酸铜和硫酸钾是起提高反应温度,加快反应速度的作用,但加入的硫酸钾不可过多,因为硫酸钾加入量过多,可导致消化液的沸点过高,从而使消化液的温度过高,在过高的温度下,硫酸会形成细小液滴携带试样而被蒸出,从而使氮损失造成结果偏低。②刚开始消化时要严格控制温度,只能做较低温度的加热,不能过高,最好使用可调电炉,或在电炉上多加几层石棉网,避免温度过高。因为刚开始消化时,消化比较激烈,泡沫也比较多,温度高,消化过于激烈沸腾,易造成试样随液体喷溅出来,或随泡沫溢出烧瓶,使试样损失,尤其是含脂肪较高的试样,试样在加热极易产生大量泡沫并溢出平外。而且消化过快时,易引起副反应,可能使部分氮被氧化变成分子状态挥发逸出,造成结果偏低;消化时过于激烈沸腾,泡沫也会将试样溅到瓶壁上、瓶颈处,高温焦化后不易洗脱,尤其是溅到瓶颈处,更不易洗脱下来,也容易造成后期消化困难和消化不完全,使结果偏低。所以消化时,一般需微微加热(10～20)min 后,泡沫减少,消化液大部分呈灰黑色透明液,二氧化硫白色烟雾增加时,方可升高温度,使溶液保持微沸状态,因为此时消化液中有许多由试样形成的炭化颗粒。

尽管前期消化时间长一些,但形成的炭化颗粒少,可使后期消化的时间大大减少,消化完全。③在消化后期,对溅附在烧瓶壁上的黑色焦化物质,须转动烧瓶将其振洗下来,以避免试样损失。在消化过程中,如硫酸———过氧化氢———水混合液消耗量大,则应酌情补加部分混合液继续消化,以避免烧瓶干枯,温度过高,造成硫酸铵过热分解,造成氨的损失。

3 　蒸馏过程对粗蛋白质测定结果的影响

蒸馏时加入蒸馏瓶内的碱溶液必须过量,因为在消化液中还有一部分硫酸,因此加入的碱液一部分将与硫酸中和,过量的碱溶液将使消化液保持较强的碱性,有利于使消化液中的氨完全蒸出,必要时可酌情多加一部分碱液。在蒸馏瓶中加入稀释后的消化液前,应注意要先将接受瓶及接受液(硼酸溶液) 准备好,并将冷凝管插入接受液的液面下,因为在加入消化液后,再加入过量的碱溶液时,消化液中的氨易挥发逸出;另外,在蒸馏瓶多次使用时,蒸馏瓶本身也具有一定温度,也易加快氨的逸出,这些都会影响分析结果准确性。以上是在粗蛋白质测定实践中总结出的几点肤浅的经验,在操作时,应严格遵守国际操作规程,掌握好操作条件,在操作中,应尽量避免氮的损失,可以取得比较准确的分析结果。