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5种入侵植物叶绿素的提取与含量测定
　紫茎泽兰( Eupatorium adenophorum Sp reng)系菊科泽兰属多年生草本植物,一般高0. 8～1. 2 m,最高可达2. 5 m,茎暗紫褐色,被灰色锈毛,叶对生,叶片棱形;头状花序,瘦果五棱形,具冠毛;具有极强的生命力,全株有毒,不仅与农田、森林争养料和水分,其纤毛、花粉等还会对人、畜造成危害。
飞机草( Eupatorium odoratum L. )为菊科植物,别名香泽兰。植株高达3～7 m,根茎粗壮,茎直立,分枝伸展;叶对生,呈卵状三角形,瘦果能借冠毛随风传播,其果实成熟季节多为干燥多风的旱季,扩散力强,蔓延迅速,种子休眠期短。植株有较强的异株克生作用,危害多种作物,并抑制邻近植物生长,还能使昆虫拒食。其叶内含香豆类素( coumarins)等有毒活性化合物,能引起皮肤红肿、起泡,误食嫩叶会引起头晕、呕吐,还可引起家畜、家禽和鱼类中毒。
空心莲子草(A lternanthera philoxeroides Bunbury)是苋科多年生宿根草本植物,别名水花生、喜旱莲子草、空心苋。茎基部匍匐,上部伸展,中空,有分枝,叶对生,长圆状倒卵形或倒卵状披针形,头状花序。根系繁殖能力强,与本地植物争夺水分、养分。
水葫芦( Eichhornia crassipes ) ,又叫凤眼莲,根生于节上,根系发达,靠毛根吸收养分水分,主根(肉根)分蘖下一代。叶单生,直立,叶片卵形或肾圆形,秆(茎)灰色,泡囊稍带点红色,嫩根为白色,老根偏黑色。多年浮水草本。
凤眼莲对其生活的水面采取野蛮的封锁,挡住阳光,导致水下植物得不到足够光照而死亡,破坏水下动物的食物链,导致水生动物死亡。同时,凤眼莲还有富集重金属的能力,死后腐烂体沉入水底形成重金属高含量层,直接杀伤底栖生物。马缨丹(Lantana cam ara L inn. )系马鞭草科多年生植物,又叫五色梅、臭草。多年生蔓性灌木,高1～2 m,叶对生,卵形或心脏形,有臭味。茎枝方柱形,通常有短而下弯的细刺和柔毛。枝叶及未熟果有毒,人畜误食会造成慢性肝中毒,有发烧、衰弱、呕吐、腹泻、步履不稳、呼吸急促、昏迷、黄疸等症状。
以上5种植物都是云南常见的入侵植物,对农业生产造成危害,对人畜健康造成影响,对自然环境产生破坏作用;但这些植物都是绿色植物,具有叶绿素,如果能把这些植物中的叶绿素加以充分利用,即能变废为宝。叶绿素不仅在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用,而且还具有造血功能,可解除体内杀虫剂与药物残留,并具有养颜美肤以及多种保健功能(如提供维生素、维持酶活性、解毒、消炎、脱臭) 。就以上5种入侵植物的叶绿素提取工艺进行研究并测定叶绿素含量,可为有效控制这些有害植物的生态危害及进一步合理利用奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
紫茎泽兰、飞机草、空心莲子草、马缨丹采集于楚雄师范学院校园内,水葫芦采集于校园南大门外池塘。5种试材均由楚雄师范学院李国树鉴定。另外还需要几款测定叶绿素含量的仪器，如叶绿素含量测定仪、SPAD502叶绿素仪。1. 2　方法
1. 2. 1　叶绿素的提取　本试验采用超声波处理和未超声处理2种方法,分别提取5种植物的叶绿素。超声波处理:每个样品取新鲜试材3 g,剪碎,加入5 ml 80%丙酮、少许碳酸钙和石英砂研磨匀浆,转入25 ml烧杯,用KQ5200B 型超声波清洗器30 ℃超声处理5 min,过滤,滤液转入10 ml量筒中,加入少量80%丙酮将研钵洗净,过滤后滤液一并转入量筒中,定容至10 ml,混匀,取5 ml转入25 ml量筒中,加入80%丙酮,并定容至25 ml。未超声处理:操作过程同上,仅省略超声波处理程序。
1. 2. 2　叶绿素的光吸收测定及其比较　利用UV - 2401PC型紫外分光光度计,测定超声波处理和未超声处理提取液在663 nm和645 nm的吸光度,以80%丙酮为对照;计算样品叶绿素含量。同时,利用TZZS可见光光度计测定样品663 nm和645 nm处吸光度,并分别计算样品叶绿素含量。
2　结果与分析
2. 1　叶绿素吸收峰的分析比较
2. 1. 1　水葫芦中叶绿素的吸光度　经过超声处理和未超声处理的水葫芦提取液中叶绿素的吸收峰和吸光度见图1和表1。表1结果表明,水葫芦超声处理和未超声处理的提取液中叶绿素最高吸收峰在波长330. 00、330. 50 nm处,最高Abs分别为2. 530 0和3. 474 8。说明水葫芦在不超声处理的提取液中叶绿素吸光度高,在提取水葫芦叶绿素时不用超声波处理,直接提取效果更好。
2. 1. 2　紫茎泽兰中叶绿素的吸光度　经过超声处理和未超声处理的的紫茎泽兰提取液中叶绿素的吸收峰和吸光度见图2和表2。由表2可知,紫茎泽兰超声处理和未超声处理的提取液中叶绿素吸光度最高峰在波长319 nm和325 nm处,Abs均为5. 000 0,说明紫茎泽兰超声处理和未超声处理提取液中叶绿素吸光度一样。
2. 1. 3　马缨丹中叶绿素的吸光度　经过超声处理和未超声处理的马缨丹提取液中叶绿素的吸收峰和吸光度见图3和表3。由表3表明,马缨丹超声处理和未超声处理的提取液中叶绿素分别在波长321. 50 nm和326. 00 nm处有最高吸收峰,Abs均为5. 000 0,说明马缨丹超声处理和未超声处理的提取液中叶绿素吸光度相同。
2. 1. 4　空心莲子草中叶绿素的吸光度　经过超声处理和未超声处理的空心莲子草提取液中叶绿素的吸收峰和吸光度见图4和表4。由表4表明,空心莲子草超声处理和未超声处理的提取液中叶绿素吸光度在波长432. 50 nm和343. 50 nm处有最高吸收峰,Abs分别为3. 640 7和5. 000 0,说明空心莲子草的叶绿素不超声处理提取效果更好。
2. 1. 5　飞机草中叶绿素的吸光度　经过超声处理和未超声处理的飞机草提取液中叶绿素的吸收峰和吸光度见图5和表5。由表5表明,经过超声处理和未超声处理的飞机草提取液中叶绿素在波长331. 00 nm和330. 50 nm处有最高吸收峰,Abs分别为5. 000 0和3. 031 4,说明飞机草中叶绿素经过超声处理提取,效果更好。
2. 1. 6　5种植物超声处理后的吸收峰比较　由图6可知,水葫芦、紫茎泽兰、马缨丹、空心莲子草、飞机草等5种植物超声处理后,紫茎泽兰、马缨丹和飞机草的最高吸收峰基本相同,而水葫芦和空心莲子草的最高吸收峰有明显差异,即不同的植物材料经过超声处理后效果不同。
2. 1. 7　5种植物未超声处理的吸收峰比较　由图7可知,水葫芦、紫茎泽兰、马缨丹、空心莲子草、飞机草等5种植物不经过超声处理,紫茎泽兰、马缨丹、空心莲子草等3种植物的最高吸收峰基本相同,水葫芦和飞机草的最高吸收峰有明显差异,即5种植物不超声处理直接提取效果一样。
2. 2　叶绿素浓度的比较
2. 2. 1　5种植物超声处理叶绿素浓度测定　用UV - 2401PC型紫外分光光度计测定5种植物超声处理后提取液在波长为663 nm和645 nm 的叶绿素浓度(表6) 。表6结果表明,在波长663 nm 下,空心莲子草的叶绿素浓度最高( 0. 016 7mg/L) 。在波长645 nm 下, 马缨丹的叶绿素浓度最高(0. 029 8 mg/L) 。说明在经过超声波处理的条件下,水葫芦、马缨丹、空心莲子草等在波长663 nm下测浓度为宜,紫茎泽兰、飞机草在波长645 nm下测定浓度为宜。
2. 2. 2　5 种植物未超声处理叶绿素浓度测定　用UV -2401PC型紫外分光光度计测5种植物未超声处理提取液在波长为663 nm和645 nm下的叶绿素浓度(表7) 。表7 表明,在波长663 nm 下, 空心莲子草的叶绿素浓度最高(0. 046 5 mg/L) ;在波长645 nm下,紫茎泽兰的叶绿素浓度最高(0. 032 6 mg/L) 。说明在直接提取的条件下,在波长为663 nm下测定空心莲子草、飞机草的叶绿素为宜,波长为645nm下测定水葫芦、紫茎泽兰、马缨丹的叶绿素为宜。2. 3　用722S型可见分光光度计测叶绿素吸光度及含量在波长663 nm和645 nm下,用722S型可见分光光度计测量5种植物提取液叶绿素的吸光度(表8) 。
根据文献[ 2 - 3 ]的方法,将测得的数值代入公式: ( 1) Ca(mg/L) = 12. 7A663 - 2. 69A645 ; ( 2 ) Cb (mg/L ) = 22. 9A645 -4. 68A663 ; (3) Ct =Ca + Cb = 8. 02A663 + 20. 21A645 ,计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。最后再根据叶绿素提取液浓度计算出单位鲜重叶片中叶绿素的含量(表9、表10) 。
经SPSS软件对两种方法提取的叶绿素含量进行处理,得5种植物叶绿素含量的估计边缘均值,结果空心莲子草叶绿素含量最高,为0. 430 250 mg/g FW;紫茎泽兰的叶绿素含量第二,为0. 370 750 mg/g FW; 马缨丹叶绿素含量第三, 为0. 337 750 mg/g FW; 飞机草第四, 叶绿素含量为0. 310 060mg/g FW;水葫芦叶绿素含量最低,为0. 111 750 mg/g FW。经统计分析,无论是超声处理还是未超声处理, 5种植物间总叶绿素含量差异均达极显著水平,两种方法测定的叶绿素含量差异也达极显著水平。经过超声处理后,空心莲子草叶绿素含量最高,其次是飞机草,再次是马缨丹,然后是紫茎泽兰,最低的是水葫芦。未经超声波处理直接提取叶绿素时,紫茎泽兰叶绿素含量最高,其次是空心莲子草,再次是马缨丹,然后是飞机草,最低的是水葫芦。两种方法比较,马缨丹、空心莲子草和飞机草超声处理后提取的叶绿素含量比未超声处理提取的高;紫茎泽兰的比未超声处理提取的低,而水葫芦没明显差异。
3　讨论
3. 1　环境因素对叶绿素的影响
杜敏华对女贞、大叶黄杨、月季、金叶女贞、三叶草等5种常见城市绿化植物进行了大气污染对其叶绿素含量影响的研究,认为污染严重的城市区域叶绿素总含量相对较低。那么,其他环境因素,如干旱、低温、元素缺乏等是否会影响水葫芦、紫茎泽兰、马缨丹、空心莲子草、飞机草等5种植物叶绿素的含量? 这有待进一步探讨。
3. 2　5种植物的应用前景
游秀花等以杉木针叶提取叶绿素,经皂化、锌代及成盐反应制备叶绿素锌钠盐。马自超用竹叶制取叶绿素铜钠盐。能否将水葫芦、紫茎泽兰、马缨丹、空心莲子草、飞机草等5种植物中所含的叶绿素转换为叶绿素铜钠、叶绿素锌钠呢? 这5种植物的色素中是否含有毒性? 如果有,如何脱毒效果最好? 这些问题还有待于进一步研究。
4　结论
通过不同的处理方法进行叶绿素提取,发现用不同的处理方法,紫茎泽兰在波长为310. 00 nm和325. 00 nm条件下,叶绿素吸光度相同且最高(Abs为5. 000 0) 。紫茎泽兰、空心莲子草、飞机草、水葫芦、马缨丹5种植物材料中,叶绿素含量差异极显著。5种材料的叶绿素含量从高到底依次为空心莲子草(0. 430 250 mg/g FW) 、紫茎泽兰(0. 370 075 mg/g FW) 、马缨丹(0. 337 750 mg/g FW) 、飞机草( 0. 310 660mg/g FW) 、水葫芦( 0. 111 750 mg/g FW) 。超声处理后提取叶绿素和不处理直接提取叶绿素,差异极显著。紫茎泽兰以不处理直接提取为宜,马缨丹、空心莲子草和飞机草超声处理后再提取为宜,水葫芦不受超声处理影响。这5种常见入侵植物叶绿素的提取和应用前景中,空心莲子草是叶绿素提取的最佳材料,其次是紫茎泽兰和马缨丹。