叶绿素是植物吸收光能进行光合作用的重要物质基础，它直接参与光能的吸收、传递、分配和转化等过程，其含量的大小以及a/b的相对比值不仅可以反映植物的生长发育状况、生理代谢水平及营养条件，还可作为环境生理研究的重要参考指标[1]。因此，对其含量及a/b比值进行测定与分析一直是植物生理学研究的重点内容。

叶绿素是脂溶性卟啉类化合物，在分子结构上，叶绿素由脱镁卟啉环、叶绿酸、叶绿醇、甲醇和二价镁离子等部分构成，各叶绿素结构之间的差别很小，叶绿素a和b仅在吡咯环Ⅱ上的附加基团不同：前者是甲基，后者是甲醛基；在光学特性上，叶绿素a和b及其衍生物对红光区(620~700 nm)和蓝紫光区(400~500 nm)的光吸收特别强烈；而对绿光区(520~580 nm)的光则吸收较弱，因而叶绿素呈现绿色。

目前，叶绿素的提取方法主要有有机溶剂萃取法、超临界CO2萃取法、吸附树脂萃取法、超声波萃取法和微波萃取法等。其中微波辅助萃取法和超临界CO2萃取法由于能够大大降低提取时间，并减少萃取溶剂的使用量，逐渐受到人们的关注，但超临界CO2萃取法受操作复杂、设备昂贵、成本较高等因素的困扰，其应用领域也受到限制。有机溶剂萃取法有直接利用叶绿素易溶于有机溶剂的特点，选用合适的有机溶剂进行萃取，并辅助了微波、超声波或离子交换分离等手段来提高效率和纯度。因此，有机溶剂萃取法是最常用的叶绿素提取的常规方法。叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、荧光分析法、叶绿素测量仪法、光声光谱法和高效液相色谱法等，其中分光光度法具有准确度高的特点，是叶绿素含量测定过程中应用最为广泛的方法。

笔者拟采用有机溶剂萃取法从桑叶中提取叶绿素，并利用分光光度法对叶绿素含量进行测定，通过分析不同节位桑叶及桑叶不同部位的叶绿素含量，探讨桑叶叶绿素的光谱特征及其含量的变化规律，以期为桑叶叶绿素的提取及含量测定提供方法性参考，并为桑叶叶绿素的进一步研究提供参考数据。

1材料与方法：

1.1材料

1.1.1试验材料：桑叶，采自中国农业科学院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃。

1.1.2主要试剂：试验所用试剂均为分析纯。

1.1.3主要仪器：UV-9100型紫外-可见分光光度计，由浙江托普分析仪器有限公司生产；电热恒温水浴锅，由杭州麦哲仪器设备厂生产；YP5001型电子天平，由浙江托普仪器厂生产；打孔器(d=0. 6 cm)。

1.2方法：

1.2.1叶绿素的提取含量测定方法。将采集到的新鲜桑叶带回实验室洗净、擦干后，用直径为0.6 cm的打孔器打成小圆片；选取5片称重，然后用6ml有机溶剂在暗室浸提24 h；于5 000 r/min离心机中离心5min，取上清液置于光径为1.0 cm的比色皿中，用紫外-可见分光光度计测定其吸光值，并利用Arnon法的修正公式对其叶绿素含量进行计算，分析桑叶叶绿素的光谱特征，进而比较研究不同节位桑叶和桑叶不同部位叶绿素含量的变化规律，绿素含量用Arnon法的修正公式进行计算：

其中，V为萃取溶剂体积(ml)；S为表面积(cm2)，通过样品个数(5片)与打孔器面积(d=0.6 cm)之积进行计算；Ca为叶绿素a含量，Cb为叶绿素b含量，Ca+b为叶绿素a和b的含量之和；A645、A663分别代表在波长为645 nm和663 nm下的吸光度值，所有试验均重复3次。

1.2.2　桑叶叶绿素光谱特征分析。用紫外-可见分光光度计在360~700 nm的波长范围内，测定不同波长条件下，桑叶叶绿素的吸光度值，绘制桑叶叶绿素的光谱图。

2结果与分析：

2.1桑叶叶绿素的光谱特征：

通过测定不同波长条件下桑叶叶绿素的含量，绘制出其光谱图(图1)，由图1可知：在试验范围内，桑叶叶绿素有2个强吸收带，分别为400~460 nm和640~680 nm，其中400~460 nm为蓝紫光区，吸收最高峰出现在432 nm处，而640~680 nm是红光区，且在662 nm处出现最高吸收峰，这是由于叶绿素中的叶绿素a和叶绿素b分别在这2个波长处吸收最强，所得结果与其他高等植物叶片中叶绿素的吸收光谱图基本一致。

2.3 桑叶不同部位的叶绿素含量测定结果：

一片桑叶因不同的光照强度、营养状况及生理条件间的细微差别，会导致桑叶不同部位中叶绿素含量也有差异。该研究将桑叶分为3部分，即叶尖、叶中和叶柄，分别测定不同部位的叶绿素含量，结果如图3所示。

由图3可知，靠近叶柄处叶绿素含量明显高于其他部位，叶绿素含量高低顺序为叶柄处(叶中部(叶尖部，呈现出下部叶位大于上部叶位的规律。这可能是因为植物的氮素营养是从成熟叶片向幼嫩叶片转运，叶绿素含量成熟叶多于幼嫩叶，使桑树叶片叶色随之发生相应变化而导致吸光值的不同。此外，叶尖部的叶绿素a/b比值最低，叶柄处的最高，叶中部其次，说明桑叶叶尖部最耐阴，叶绿素b含量较高，可适应阴生生境，而叶柄部相对最不耐阴。

3结论与讨论：

对叶绿素进行准确测定是植物生理学的重点研究内容，叶绿素a和b含量的多少直接影响光合速率的大小，叶绿素a/b值也能反映一定的光合速率， a/b值高，光合活性也高，光合活性高，植物就具有较高的光合速率。试验结果表明：

①桑叶叶绿素光谱特征与其他高等植物叶绿素的光谱特征类似，可采用Arnon法的修正公式对叶绿素含量进行计算。

②中间节位的桑叶中叶绿素含量最高，但其叶绿素a/b的比值却最小，虽然该结果存在一定争议，但从叶绿素含量来看，桑树光合作用的叶绿素主要来源是中部节位的叶片。

③对同一片叶子而言，因光照强度、营养状况和生理条件的不同，不同部位叶片的叶绿素含量会有所不同，该研究结果证实了这一点。研究发现，叶柄处的叶绿素含量最高， a/b值也最高，说明在叶柄处的光合速率最高，且由于叶绿素b的含量较低，说明叶柄处较适应阳性生境，而叶尖处与其正好相反。

试验仅对桑叶中叶绿素的光谱特征及其含量的变化规律进行了初步探讨，该结果为叶绿素的进一步研究提供了必要的参考依据和数据支持。