化学发光分析方法测量蛋白质含量的优势及步骤
来源： http://www.grainyq.com/ 类别：实用技术 更新时间：2013-03-07 阅读次
【本资讯由中国粮油仪器网提供】 目前，蛋白质的测定方法有双缩脲法、Lowry法、Bradford法、染料结合分光光度法、液相色谱法、毛细管电泳法、自动型凯氏定氮仪等。化学发光分析方法由于灵敏度高、分析速度快、装置简便的特点，在食品和环境监测、生物和医学领域显示出广泛的应用前景。已有大量文献报道了流动注射化学发光法用于金属离子、氨基酸和药物分析测定，也有一些用于蛋白质检测方面的报道。本试验发现某些蛋白质对鲁米诺-铁氰化钾体系发光反应具有很强的增敏特性，并通过优化反应的各种条件，建立了一种测定蛋白质的分析方法。仪器与试剂自行组装的流动注射化学发光仪，包括IFIS-C型智能流动注射进样器和CL流通池；R-212型光电倍增管；ND-802型直流前置放大器；HW-2000色谱工作站；818型酸度计。鲁米诺储备溶液：2.0×10-2mol•L-1；铁氰化钾储备液：0.05mol•L-1；氢氧化钠溶液：1.0mol•L-1；卵清白蛋白(OVA)储备溶液：0.5mg•mL-1；牛血清白蛋白(BSA)储备溶液：0.5mg•mL-1；溴化十六烷基三甲基胺(CTMAB)标准溶液：1.0×10-2mol•L-1；十二烷基磺酸钠(SDS)溶液：5.0×10-2mol•L-1；溴化钾溶液：2.5mol•L-1；聚乙二醇辛基苯基醚(OP)溶液：2.0×10-2mol•L-1；β-环糊精(β-CD)溶液：2.0×10-2mol•L-1；三氯甲烷、乙醇、甲醇和乙腈均为体积分数为20%的水溶液。试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。试验方法分析流路见图1，鲁米诺、铁氰化钾溶液(A泵)及载流、试样(B泵)分别由两蠕动泵输入。从进样阀出来的试样在流经反应器时与载流在一定程度上相混，两相反应的产物在流经流通池时得到检测，信号由光电倍增管(PMT)放大，然后输出。
流速的选择化学发光流动注射体系中，流速太慢会导致最大发光信号出现在进入流通池之前；流速太快会导致最大发光信号出现在进入流通池之后，都不能被光电倍增管完全检测。选择载流、试样的流速为5.0mL•min-1，鲁米诺与铁氰化钾的流速为4.0mL•min-1。鲁米诺浓度的选择在卵清白蛋白-鲁米诺-铁氰化钾和牛血清白蛋白-鲁米诺-铁氰化钾两体系中，当鲁米诺的浓度在2.0×10-6~8.0×10-5mol•L-1范围，随着浓度的增加，两体系的相对发光强度也增大，但当鲁米诺浓度超过5.0×10-5mol•L-1时，相对发光强度均降低。鲁米诺浓度为5.0×10-5mol•L-1时，峰形好，信噪比(S/N=3)最佳。选择鲁米诺浓度为5.0×10-5mol•L-1。铁氰化钾浓度的选择试验结果表明：铁氰化钾浓度为6.0×10-4mol•L-1时相对发光强度达到最大；随后铁氰化钾浓度继续增大，蛋白质发光体系的相对发光强度反而降低。试剂pH值的选择试验结果表明：铁氰化钾与鲁米诺的酸度对发光体系的相对发光强度都有明显的影响，在pH为12.0和pH为12.2时，卵清白蛋白和牛血清白蛋白的发光强度和信噪比(S/N=3)达到最大。试样pH值的选择试验结果表明：卵清白蛋白和牛血清白蛋白在pH9.0~12.2，pH9.0~12.5范围内，体系的相对发光强度随着试样溶液的pH值升高而增大；随后试样的pH增大相对发光强度反而降低，而且噪音增大峰形变差。选择试样溶液的pH分别为12.2和12.5。增敏剂的选择试验结果表明：聚乙二醇辛基苯基醚的加入使反应的相对发光强度降低；溴化钾和β-环糊精能明显增强鲁米诺-铁氰化钾体系相对发光强度，但对蛋白质-鲁米诺-铁氰化钾无协同增强作用；十二烷基磺酸钠、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未显示出明显的协同催化效果，溴化十六烷基三甲基胺对该体系的发光具有明显增强作用。试验选择5.0×10-5mol•L-1溴化十六烷基三甲基胺溶液。化学发光曲线图2为蛋白质标准样品的化学发光曲线，试验结果表明：蛋白质对鲁米诺-铁氰化钾发光体系催化效应比较强；体系的反应迅速；化学发光体系有良好的稳定性和重现性。共存物质的影响在选定的试验条件下，考察了多种物质对3.0×10-8mol•L-1牛血清白蛋白发光强度的影响，试验结果表明：1000倍的甲醇、乙醇、EDTA、SO2-4、NO-3、F-；100倍的CHCl3、乙腈；50倍的亮氨酸；500倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸和谷氨酸；100倍的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+；1倍的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Cr6+；0.1倍的Ni2+、Co2+；大量的Na+、K+不干扰。Cr3+、OVA干扰严重。加入与金属离子反应比例为1∶1的EDTA可以消除Mn2+以外的大部分金属离子的干扰，加入100倍的EDTA后可完全消除金属离子的干扰。线性范围、检出限与精密度在选定的试验条件下，牛血清白蛋白和卵清白蛋白分别在1.5×10-10~3.8×10-7mol•L-1、1.8×10-10~2.2×10-7mol•L-1范围内呈线性关系，回归方程分别为I=3.0×109C+197.53(r=0.9988)和I=1.0×1010C+527.18(r=0.9964)；检出限(S/N=3)分别为1.5×10-10mol•L-1、1.8×10-10mol•L-1；对7.6×10-8mol•L-1牛血清白蛋白标准样品重复6次测定，相对标准偏差为0.88%。样品测定结果按试验方法对人体血清(用水稀释1000倍)中的蛋白质总量进行测定。
本方法测定值Protein foundby thismethodρ/(g•L-1)RSD/%加标量Am′t ofstd. addedρ/(g•L-1)回收量Am′trecovered双缩脲法测定值Protein foundby the Biuretmethodρ/(g•L-1)1 78.9 1.55 60.0 54.1 78.52 83.8 2.54 10.0 11.3 83.93 74.6 3.71 20.0 21.4 75.84 84.0 2.38 20.0 18.5 81.85 81.2 2.31 40.0 41.8 80.56 83.0 2.64 40.0 36.6 83.8本法测定蛋白质与经典的双缩脲法相比，线性范围宽、检出限低、灵敏度高，对人体血清样品测定的结果表明，本法具有与双缩脲法相当的准确度。
流速的选择化学发光流动注射体系中，流速太慢会导致最大发光信号出现在进入流通池之前；流速太快会导致最大发光信号出现在进入流通池之后，都不能被光电倍增管完全检测。选择载流、试样的流速为5.0mL•min-1，鲁米诺与铁氰化钾的流速为4.0mL•min-1。鲁米诺浓度的选择在卵清白蛋白-鲁米诺-铁氰化钾和牛血清白蛋白-鲁米诺-铁氰化钾两体系中，当鲁米诺的浓度在2.0×10-6~8.0×10-5mol•L-1范围，随着浓度的增加，两体系的相对发光强度也增大，但当鲁米诺浓度超过5.0×10-5mol•L-1时，相对发光强度均降低。鲁米诺浓度为5.0×10-5mol•L-1时，峰形好，信噪比(S/N=3)最佳。选择鲁米诺浓度为5.0×10-5mol•L-1。铁氰化钾浓度的选择试验结果表明：铁氰化钾浓度为6.0×10-4mol•L-1时相对发光强度达到最大；随后铁氰化钾浓度继续增大，蛋白质发光体系的相对发光强度反而降低。试剂pH值的选择试验结果表明：铁氰化钾与鲁米诺的酸度对发光体系的相对发光强度都有明显的影响，在pH为12.0和pH为12.2时，卵清白蛋白和牛血清白蛋白的发光强度和信噪比(S/N=3)达到最大。试样pH值的选择试验结果表明：卵清白蛋白和牛血清白蛋白在pH9.0~12.2，pH9.0~12.5范围内，体系的相对发光强度随着试样溶液的pH值升高而增大；随后试样的pH增大相对发光强度反而降低，而且噪音增大峰形变差。选择试样溶液的pH分别为12.2和12.5。增敏剂的选择试验结果表明：聚乙二醇辛基苯基醚的加入使反应的相对发光强度降低；溴化钾和β-环糊精能明显增强鲁米诺-铁氰化钾体系相对发光强度，但对蛋白质-鲁米诺-铁氰化钾无协同增强作用；十二烷基磺酸钠、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未显示出明显的协同催化效果，溴化十六烷基三甲基胺对该体系的发光具有明显增强作用。试验选择5.0×10-5mol•L-1溴化十六烷基三甲基胺溶液。化学发光曲线图2为蛋白质标准样品的化学发光曲线，试验结果表明：蛋白质对鲁米诺-铁氰化钾发光体系催化效应比较强；体系的反应迅速；化学发光体系有良好的稳定性和重现性。共存物质的影响在选定的试验条件下，考察了多种物质对3.0×10-8mol•L-1牛血清白蛋白发光强度的影响，试验结果表明：1000倍的甲醇、乙醇、EDTA、SO2-4、NO-3、F-；100倍的CHCl3、乙腈；50倍的亮氨酸；500倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸和谷氨酸；100倍的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+；1倍的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Cr6+；0.1倍的Ni2+、Co2+；大量的Na+、K+不干扰。Cr3+、OVA干扰严重。加入与金属离子反应比例为1∶1的EDTA可以消除Mn2+以外的大部分金属离子的干扰，加入100倍的EDTA后可完全消除金属离子的干扰。线性范围、检出限与精密度在选定的试验条件下，牛血清白蛋白和卵清白蛋白分别在1.5×10-10~3.8×10-7mol•L-1、1.8×10-10~2.2×10-7mol•L-1范围内呈线性关系，回归方程分别为I=3.0×109C+197.53(r=0.9988)和I=1.0×1010C+527.18(r=0.9964)；检出限(S/N=3)分别为1.5×10-10mol•L-1、1.8×10-10mol•L-1；对7.6×10-8mol•L-1牛血清白蛋白标准样品重复6次测定，相对标准偏差为0.88%。样品测定结果按试验方法对人体血清(用水稀释1000倍)中的蛋白质总量进行测定。
本方法测定值Protein foundby thismethodρ/(g•L-1)RSD/%加标量Am′t ofstd. addedρ/(g•L-1)回收量Am′trecovered双缩脲法测定值Protein foundby the Biuretmethodρ/(g•L-1)1 78.9 1.55 60.0 54.1 78.52 83.8 2.54 10.0 11.3 83.93 74.6 3.71 20.0 21.4 75.84 84.0 2.38 20.0 18.5 81.85 81.2 2.31 40.0 41.8 80.56 83.0 2.64 40.0 36.6 83.8本法测定蛋白质与经典的双缩脲法相比，线性范围宽、检出限低、灵敏度高，对人体血清样品测定的结果表明，本法具有与双缩脲法相当的准确度。
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