在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

10.1 pH8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。

10.2 显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4° C冰箱中保存。

10.3 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

10.4 乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3 min的吸光度变化D A0值应控制在0. 3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过四天。

10.5 可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的D A0值应控制在0. 3以上。

11 仪器

11.1 分光光度计或相应测定仪及常量天平。

12 分析步骤

12.1 样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1~2min，倒出提取液，静置3~5min，待用。

12.2 对照溶液测试： 先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37° C放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值DA0。

12.3 样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值DAt。

13 结果的表述计算

13.1 结果计算

检测结果按公式计算：抑制率(%)=[ (DA0-DAt)/ DA0]×100

式中：DA0 棗对照溶液反应3min吸光度的变化值； DAt 棗样品溶液反应3min吸光度的变化值；

13.2 结果判定

结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。对阳性结果的样品，可用其它方法进一步确定具体农药品种和含量。

14 附则

14.1酶抑制率法技术指标

14.1.1 灵敏度指标：酶抑制率法对部分农药的检出限见表2酶抑制率法对部分农药的检出限

农药名称 检出限mg/kg 农药名称 检出限mg/kg

敌敌畏 0.1 氧化乐果 0.8

对硫磷 1.0 甲基异柳磷 5.0

辛硫磷 0.3 灭多威 0.1

甲胺磷 2.0 丁硫克百威 0.05

马拉硫磷 4.0 敌百虫 0.2

乐果 3.0 呋南丹 0.05

14.1.2 符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。

15 说明

15.1 葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

15.2 当温度条件低于37° C，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化D A0值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3min的吸光度变化D A0值＜0.3 的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。

15.3 当吸光度大到无法读取时，说明测定液浑浊有干扰。

16 方法注释

16.1 两种方法的共同点：以上两种方法的原理、缓冲（提取）溶液pH值、测定中的干扰物质和排除方法基本相同。

16.2 速测卡法的检出限：方法文本中的表1，是由卫生部食品卫生监督检验所、广东省食品卫生监督检验所、北京市产品质量监督检验所、香港政府化验所、广东省农药检定所、深圳市卫生防疫站、华南农大昆虫毒理研究室七个单位，使用速测卡法，对我国常见使用的一些有机磷和氨基甲酸酯类农药检出限的实验与验证数据的统计表。从表1可以看出，在使用速测卡法检出蔬菜样品为农药阳性时，即可视为有机磷或氨基甲酸酯类的农药已超标。在有条件的单位，可用气相色谱仪或质谱仪对阳性试样进行进一步的实验来确定是哪种农药、确切含量。

16.3 酶抑制率法的选择：在气相色谱分析仪还未问世及分布较少时，对有机磷类农药的检测即采取了酶抑制分光光度法，只是由于当时酶的纯度不够高、灵敏度较低、酶试剂保存期短、及方法不能区分出具体的农药而被气相色谱法所取代。而今用其作为快速分析则恰到好处。只是现在酶试剂的质量还应进一步提高，有效保存期应设法延长。由于这两个现实情况，在实验前，必需测试酶的活性，达到要求后才能往下进行。 

16.4 速测卡法操作简单、使用方便，常温下试药的有效期可达一年。酶抑制率光度法与速测卡法比较操作要烦琐些，夏天时，试药需要冷藏运输，但以数字形式读取数据，较为直观。中国粮油仪器网 http://www.grainyq.com