叶绿素是光合作用中最重要的色素, 与光合性能和籽粒产量密切相关。关于作物叶绿素含量的遗传分析, 在水稻、小麦、大麦、棉花和高粱等作物中都有研究报道, 主要结果集中在不同发育时期叶绿素含量的QTL 检测, 也有高叶绿素含量基因的发掘。但是, 有关大豆叶绿素含量遗传分析报道较少, 目前已检测了铁缺乏黄化的QTL和叶绿素缺乏的两个基因座, 有关不同生育时期叶绿素含量QTL 检测也只有崔世友等的报道。更重要地, 有关多环境条件下不同生育时期叶绿素含量的遗传分析很少。为此, 本研究将开展不同环境条件下大豆不同生育时期叶绿素含量的遗传研究, 解析其遗传基础。

本研究利用已构建的溧水中子黄豆×南农493-1组合244 株F2 群体150 个SSR 分子标记, 利用SPAD-502 叶绿素仪分别于2007 年和2008 年在南京农业大学江浦试验站和临沂市农业科学院试验站测定了叶绿素含量13 次, 用复合区间作图法分析了叶绿素含量的动态表达, 检测到控制叶绿素含量的主效QTL, 并探讨不同环境和不同生长时期下, 控制大豆叶绿素含量的QTL 的规律性, 为大豆高产育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

2005 年夏, 在南京农业大学江浦试验站配制溧水中子黄豆(P1)×南农493-1(P2)杂种F1, 同年在海南南繁获得F2 种子。2006 年夏, 在南京农业大学江浦试验站种植F2 种子, 获得244 株F2 群体。小区行长3 m, 行距50 cm, 株距10 cm。采用系谱法衍生F2:3和F2:4 家系群体。2007 年夏, 在南京农业大学江浦试验站, 按每F2:3家系种植3 行小区, 完全随机设计,小区行长2 m, 株距10 cm, 成熟时中间一行单独收获考种。2008 年夏, 在南京农业大学江浦试验站和山东临沂农业科学院试验站, 按2007 年种植F2:3 家系方式种植F2:4 家系群体。

1.2 SSR 遗传图谱的构建

参照SSR 标记“大豆公共遗传图谱” 从大豆数据库SoyBase (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得SSR 引物序列972 对, 由上海英骏生物技术有限公司合成。筛选出亲本和F2 群体间有多态性的SSR引物150 对。

采用Saghai-Maroof 等[16]报道的CTAB 方法提取DNA。PCR 总体积为15 μL, 含模板DNA (20 ngμL–1) 5 μL, 10×PCR buffer [含200 mmol L–1 Tris-HCl(pH 8.4) 、200 mmol L–1 KCl 、100 mmol L–1(NH4)2SO4、15 mmol L–1 Mg2+] 1.5 μL, 10 mmol L–1dNTP 0.2 μL, 5 U μL–1 Taq 酶0.15 μL, 10 pmol 引物3μL, ddH2O 5.15 μL。PCR 程序为95℃预变性2 min;94℃变性30, 退火(不同引物退火温度介于47~55℃之间) 45℃, 72℃延伸1 min, 35 个循环; 最后72℃延伸10 min, 4℃保存。用8%非变性聚丙烯酰胺胶对扩增产物进行分离, 银染检测。

采用Joinmap 3.0 软件包构建连锁图。用Group 命令, 以LOD 值大于3.0 进行人工分组, 每一个Group 可以采用不同的LOD 值标准, 然后选择Calculate map 命令, 用Kosambi 作图函数进行重组率与遗传距离间转换, 参考大豆公共遗传图谱整合染色体上标记。

1.3 叶绿素含量的测定

在苗期第7 片复叶展开时, 对亲本及其每个F2衍生家系的中间行取生长正常单株的倒3 复叶功能叶的中间叶片, 每家系固定观测5 株, 用日本产SPAD-502 型叶绿素计数仪测定每单株1 片叶的上、中、下3 点, 以平均值SPAD 值度量该叶片的叶绿素含量。

2007 年在江浦试验站, 采用每周测量1 次的方式(24/7、30/7、5/8、11/8、17/8、23/8、29/8 和4/9,日/月), 从苗期到盛花期共测量8 次(数据集I)。2008年在江浦试验站, 只在初花期(8 月8 日)测1 次(数据集II)。2008 年在临沂农业科学院试验站, 从苗期到初花期共测4 次(14/7、20/7、26/7 和1/8, 日/月)(数据集III)。

1.4 QTL 定位方法

利用Win QTL Cartographer v2.5 软件包的复合区间作图(composite interval mapping, CIM)分析数据集I~III, 以向前逐步回归分析方法选择协变量标记控制遗传背景, 其他按标准设置。以LOD 值大于2.5 作为QTL 存在的阈值。用MapChart 2.2 将QTL 定位结果绘制成QTL图。按照QTL+性状+连锁群+数字命名QTL, 其中QTL 以小写q 开头, 性状以英文缩写表示, 数字表示同一性状在该连锁群上检测到的不同QTL 个数。

2 结果与分析

2.1 不同时间叶绿素含量的表型变异特征

从表1 可知, 溧水中子黄豆(P1)不同时间点叶绿素含量及其平均含量与南农493-1 都存在显著差异;F2:3 和F2:4 家系间也存在遗传变异, 呈偏态与非正态分布, 说明存在主效QTL 或QTL 与环境互作。

2.2 叶绿素含量QTL 的动态表达

用复合区间作图法分析数据集I~III, 检测到叶绿素含量共有20 个QTL, 结果见表2 和图1。2007 年江浦试验站的8 次测量中共检测到10个QTL, 分布在6 个连锁群上。第1~8 时间点分别检测到3、0、2、2、1、1、1 和0 个QTL, 其中1~4时期共检测到7 个QTL, 说明叶绿素合成基因在叶绿素合成前期表达较为活跃, 每个时期都有0~3 个QTL 控制叶绿素的合成; 在5~8 时期共检测到3 个QTL, 说明叶绿素的后期合成相对要少一些, 这是因为这个时期已经是大豆的鼓粒期, 叶绿素的合成已达顶峰, 以后就逐渐分解。8 次检测中, N 连锁群上的satt234~satt022 有3 次被检测到, 说明该区间可能存在控制叶绿素合成的基因; D1a 和F 连锁群上在不同基因座上都检测到2 次, 说明控制叶绿素合成的位点分布在不同的连锁群上。从贡献率上看, 大于10%的QTL 有5 个; qchl-N-1 在8 次测量中共出现3 次, 有两次贡献率较高, 分别达57%和10%。在2008 年临沂试验站的4 次测量中, 共检测到6 个QTL, 分布在6 个不同的连锁群上。第1~4 次分别检测到2、2、1 和1 个QTL。各QTL 的位置均不相同。从贡献率来看, 大于10%的有2 个; 最大贡献率14%的QTL 是qchl-D2-2。

在2008 年江浦试验站的1 次测量中, 共检测到4 个QTL, 分布在4 个连锁群上。虽然M 连锁群satt463 标记两侧都存在QTL, 但是这两个QTL 效应方向完全一样, 很可能是一个QTL, 为此只列出LOD 较大的qchl-M-1。从贡献率来看, 大于10%的是qchl-D1a-1, 为30%。

在3 个数据集的QTL 检测中, QTL 在N 连锁群上出现了4 次, 在F、D1a 和M 连锁群上出现了3次, 在K 连锁群上出现了2 次, 说明这几个连锁群可能是叶绿素合成基因的位置所在。同一地点(江浦)的不同年份间只检测到1 个共同的QTL, 即位于sat_160~satt147 间的qchl-D1a-1。江浦和临沂两地点间共同检测到1 个QTL, 位于K 连锁群上的qchl-K;相连锁的QTL 有2 个, 分别位于M 和N 连锁群。从上述结果看, 不同时期检测到的叶绿素含量QTL 多不相同, 共同QTL 比例较低, 说明多数基因的表达是分阶段的、动态的。但也有的基因表达是几个时期都进行的, 控制叶绿素含量的基因是多条染色体的多个QTL, 如qchl-N-1。

3 讨论

本文的叶绿素含量QTL 定位结果具有一定的可靠性, 表现在三方面：(1) 在同一地点(江浦)的不同年份(2007 和2008 年)间、江浦和临沂不同地点间都检测到相同的QTL, 如qchl-D1a-1; (2) 与他人的研究结果相对一致, 例如, 与崔世友等利用二年一地数据定位的叶绿素QTL 相比较, 与D1a、G 和M连锁群上satt147、satt688 和sat_391– satt150 标记连锁的QTL 是一致的, 与C2、M 和F 连锁群上的QTL是相近的; Lin 等检测的铁缺乏黄化叶绿素含量QTL 位于N 连锁群上, 这与本文在2007 年江浦试验站的8 次的检测结果中N连锁群上satt234–satt022的QTL 出现3 次的结果一致; (3) 叶绿素含量QTL与大豆光氧化QTL[23]比较, 有约70%的QTL 是连锁的, 而粒形性状QTL[24]的比例少得多(表3)。Fanizza 等认为SPAD 值能反映叶片实际叶绿素含量, 类似的研究还有较多, 如Ma 等。说明本文用SPAD 值反映植株功能叶片叶绿素含量是可行的。目前, 多数QTL 定位的研究都只局限于植株数量性状某一时间点的表现, 无法掌握不同发育时期各QTL 的效应大小和基因作用方向。为此, 需要从动态角度探索作物复杂性状的遗传学基础。实际上, 数量性状的遗传表达与发育阶段密切相关,存在基因表达的发育阶段性, 不同发育阶段的性状变化是基因的选择性有序表达的结果。数量性状受特定的微效多基因系统控制, 对数量性状在发育不同时段的基因表达和效应进行研究, 有助于揭示数量性状发育的分子遗传机理, 其研究结果对分子

标记辅助选择育种实践具有重要的指导意义。迄今为止, 已在水稻、玉米、小麦和大豆

等作物上, 从动态角度剖析了株高和分蘖等复杂性状的遗传学基础。但是, 针对叶绿素含量遗传机制的动态分析还比较少, 特别是大豆叶绿素含量。从本文结果看, 不同时间点检测到的叶绿素含量QTL差异较大, 共同的QTL 不多(N 连锁群除外)。这与曹树青等的结果相似。笔者认为, 植物体内的叶绿素不断地进行新陈代谢, 有合成也有降解, 叶绿素的生物合成是比较复杂的, 同时, 光照、温度、营养元素、氧、水分等也影响叶绿素形成。所以, 控制叶绿素含量的表达在时空上应该存在差异。这也说明叶绿素含量的遗传机制是十分复杂的, 还需要进一步剖析。

4 结论

两环境8 个发育时期共检测到20 个与叶绿素含量相关的QTL, 虽然不同发育时期间、年份间和地点间共同的QTL 较少, 但是在N、D1a、F 和K 连锁群上仍有重复出现3~4 次的QTL, 如D1a 连锁群上分子标记sat_160 和satt147 间的qchl-D1a-1。