0　引言

坛紫菜( Porphy ra ha itanensis) 属暖温带性海藻, 在我国东南沿海均有分布, 是优良海藻栽培品种之一. 但近年来坛紫菜种质退化、品质下降, 造成生长期缩短、病害严重、产量降低. 因此, 选育高产、抗病、耐高温的紫菜新品种已成为亟待解决的问题. 藻胆蛋白和叶绿素含量是紫菜品质选育方面的重要指标之一. 藻胆蛋白是红藻、蓝藻和某些甲藻中的一类特有的光合作用天然色素, 可分为藻红蛋白( PE) 、藻蓝蛋白( PC) 、别藻蓝蛋白(APC) 三大类. 藻胆蛋白具有很高的开发利用价值, 既可以作为天然色素用于食品、化妆品、染料等工业, 也可以制成荧光试剂, 用于临床医学诊断和免疫化学及生物医学等领域. 叶绿素则是一类不稳定的化合物, 叶绿素含量不仅与生长速度有很大关系, 并且干紫菜中叶绿素含量的多少与感官测定紫菜优劣最为一致. 细胞的叶绿素含量随种类和类群而有所不同, 同时还受年龄、生长率、光照和营养条件的影响. 自20世纪中叶发现藻胆蛋白以来, 国内外学者对藻胆蛋白的性质和化学组成进行了大量的研究, 而且对于海藻不同生长阶段藻胆蛋白的含量以及氮源、光照对藻胆蛋白含量的影响进行了研究. 但是,不同色泽紫菜品质的比较研究以及在实验过程中各测定条件对藻胆蛋白和叶绿素a测定结果的影响,报道甚少. 本实验旨在了解不同色泽坛紫菜在不同培养条件下的藻胆蛋白及其叶绿素a含量的差异,以及测定过程中各因素对测定结果的影响, 从而为坛紫菜优良品种的选育提供品质方面的指标.

1　材料与方法

1.1　材料

各种不同品系的坛紫菜由集美大学水产学院坛紫菜种质改良及应用实验室提供, 挑选藻体完整,颜色正常, 有光泽、弹性好的生长盛期藻体.

1.2　不同色泽藻体的培养

从褐红色、紫色、红色、桔红色、绿色5种不同色泽的藻体幼苗中挑选长度为3～5 cm、完整健康的藻体进行充气培养, 实验室内温度维持在(20 ±1) ℃, 并定期更换培养液. 待藻体生长至长度为40～80 cm时, 阴干后冷冻收藏备用.

1.3　不同温度条件藻体的培养

本温度实验设定了26、27、28、29、30 ℃共5个高温实验组和1个对照组(21 ℃) , 实验藻体包括品系Z - 17的F3、Z - 26的F3、Z - 61的F3、Z - 81的F3 4个不同品系. 挑选完整健康的实验藻体(3～5 cm) 放入锥形瓶中, 在不同温度的光照培养箱中静置培养. 光周期为12 L∶12 D, 光强为1 200～1 400 lx. 培养期间每天观察记录叶状体生长状况和溃烂程度, 摇动培养液2次以使其混合均匀. 每组藻体培养10 d, 藻体阴干后冷冻收藏备用.

1.4　藻胆蛋白与叶绿素a含量的测定

藻胆蛋白的测定方法参照文献, 略有改动. 从冰箱中取出冷冻的藻体, 称2～3 g, 用适量蒸馏水快速洗涤3遍, 平铺在干净干燥的纱布上约1～3层, 在风扇前吹干或在空调室阴干, 放在粉碎器中, 间歇粉碎至粉末状. 精确称取0.010 g和0.030 g各1 份, 放在研磨管中, 加入适量的0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液浸泡约3 min, 研磨至充分, 倒入50 mL烧杯中, 用缓冲液冲洗研磨管3次以上, 烧杯中液体总体积约为20 mL, 盖上铝箔盖子, 放入冰箱冷冻( - 20 ℃) , 然后室温避光解冻,如此反复冻融6次, 将提取液用300目筛绢网过滤至50 mL离心管中, 滤液于4 ℃、10 000 r/min离心20 min, 取上清液, 定容至50 mL, 摇匀后分别于565、615、650 nm波长下测定其OD值.叶绿素a含量的测定方法参照文献, 略有改动. 粉碎冰冻藻体的处理方法与测定藻胆蛋白的一致, 然后精确称取0.010 g和0.030 g各1份, 放在研磨管中, 加入适量的90 %的丙酮水溶液浸泡约3 min, 研磨至充分(研磨过程应避免强光照射) , 倒入40 mL的棕色磨口瓶中, 用90 %的丙酮水溶液冲洗和研磨, 盖上瓶盖, 将棕色磨口瓶放在避光的地方室温提取叶绿素24 h. 提取液用300目筛绢网过滤至50 mL离心管中, 滤液于4 ℃、10 000 r /min离心20 min, 取上清液, 测定其体积, 摇匀后分别于666、730 nm波长下测定其OD值.或者直接用手持叶绿素计、SPAD502叶绿素含量测定仪来进行测定。

1.5　阴干藻体烘干质量的测定

称取阴干藻体01100 g, 放入培养皿中于105 ℃烘干3 h, 温度稍降后即称其质量(防止吸潮).

1.6　不同前处理条件藻胆蛋白与叶绿素a含量的测定

1) 研磨与粉碎. 在对实验藻体进行处理时, 一组进行研磨, 另一组进行粉碎, 其他实验条件均相同, 分别进行藻胆蛋白与叶绿素a含量的测定.

2) 黑暗与光照. 在藻胆蛋白和叶绿素a的提取过程中, 一组避光(黑暗) , 另一组在3000 lx光照条件下提取, 其他实验条件均相同, 分别进行藻胆蛋白与叶绿素a含量的测定.

3) 被测藻体的质量. 被测藻体质量分别为0.010、0.030、0.050 g. 其他实验条件均相同, 分别进行藻胆蛋白与叶绿素a含量的测定.

4) 冻融次数. 实验藻体研磨后, 一组不冻融, 放在4 ℃冰箱中提取; 一组冻融3次; 一组冻融6次. 其他实验条件均相同, 然后分别进行藻胆蛋白含量的测定.

5) 研磨温度. 在对实验藻体进行研磨时, 一组在室温条件下研磨, 一组用4 ℃的冷水保持低温条件研磨. 其他实验条件均相同, 然后分别进行藻胆蛋白含量的测定.

1.7　数据的计算与处理

藻胆蛋白和叶绿素a含量的计算参照文献的公式计算; 数据处理用SPSS1310的单因素方差分析(one2way anova) 和t2test进行统计分析.

2　结果

2.1　不同色泽藻体的藻胆蛋白和叶绿素a含量的差异

如图1、图2所示, 不同色泽的坛紫菜藻胆蛋白和叶绿素a的含量差异较大. 在所进行测定的5种不同色泽的坛紫菜中, 褐红色型坛紫菜的藻胆蛋白和叶绿素a 的质量比均为最高, 分别达到114.87 mg/g和8.83 mg/g; 紫色型的藻胆蛋白的质量比高达108.05 mg/g, 但是叶绿素a的质量比却较低(4.64 mg/g) ; 桔红色型藻体的藻胆蛋白和叶绿素a的质量比均比较低, 分别为59.81 mg/g和4.58 mg/g; 绿色型的藻胆蛋白的质量比最低(55.39 mg/g). 统计分析表明桔红色和绿色藻胆蛋白的质量比差异显著( P < 0.05) , 其余色泽间差异极显著( P < 0.01) .

2.2　不同培养温度对藻体色素含量的影响

在不同温度的培养实验中, 随着温度升高藻体容易出现溃烂. 在28、29 ℃培养的藻体颜色明显变淡, 生长缓慢或者不生长. 在4个不同品系的温度实验中, 除Z - 26的F3外, 对照组藻体的藻胆蛋白和叶绿素a含量均低于高温培养条件下生长的藻体. 除Z - 17的F3的27 ℃实验组外, 各高温实验组藻体的藻胆蛋白和叶绿素a含量随着温度升高而增加.

2.3　不同前处理条件对藻胆蛋白和叶绿素a含量测定结果的影响

1) 研磨与粉碎. 经过研磨藻体的藻胆蛋白和叶绿素a测定结果明显高于经过粉碎的. 经过研磨,紫色型和桔色型藻体的总藻胆蛋白含量分别是经过粉碎的3.8倍和2.4倍. 经过研磨藻体的叶绿素a的质量比测定结果分别是经过粉碎的10.4倍和11.9倍.

2) 光照与黑暗. 采取避光措施的紫色型和桔色型藻体的藻胆蛋白的质量比分别比在3 000 lx光照条件下提取的高24.9 %和26.6 %. 而光照对叶绿素a测定结果的影响更大. 在光照条件下提取的紫色型和桔色型藻体的叶绿素a的质量比测定结果分别为0.48 mg/g和2.04 mg/g; 而在铝箔包裹的棕色瓶中提取的藻体, 叶绿素a的质量比分别达到4.82 mg/g和5.47 mg/g, 分别是光照下提取的10.0倍和2.7倍.

3) 被测藻体的质量. 被测藻体的质量对藻胆蛋白和叶绿素a的质量比的测定结果没有明显的影响.

4) 冻融次数与研磨温度. 藻胆蛋白的含量随着冻融次数的增加而略有增加, 研磨温度对藻胆蛋白的测定结果影响较小.

3　讨论

3.1　坛紫菜色素含量与生长的关系

坛紫菜选育可以通过蛋白质、藻胆蛋白以及叶绿素a含量、生长速度、藻体厚度等重要指标来确定其品种的优劣. 藻胆蛋白是坛紫菜光合作用中重要的辅助色素蛋白, 其中藻红蛋白在红藻的捕光色素系统中首先捕获光能, 然后传递给藻蓝蛋白, 再传递给别藻蓝蛋白; 藻胆蛋白还可以作为藻体细胞的贮存蛋白, 有利于藻类在自然界中的生存竞争. 坛紫菜在不同生长期, 藻胆蛋白总量占干坛紫菜的百分含量由初期到盛期基本不变, 到末期大幅度减少. 藻胆蛋白在藻体细胞中直接参与光合作用中的能量吸收和传递. 叶绿素a是坛紫菜重要的光合色素, 含量的高低与藻体本身的营养生长旺盛与否密切相关. 本实验结果表明不同色泽的坛紫菜4种主要色素的差异显著, 其中褐色型藻体的藻胆蛋白和叶绿素a含量较高, 相应地该品系的藻体生长较快; 而生长相对较慢的桔红色型藻体的藻胆蛋白和叶绿素a含量较低. 这充分证明了藻胆色素和叶绿素a作为紫菜光合作用的捕光色素, 与紫菜生长的关系密切.

3.2　测定条件对坛紫菜色素含量测定结果影响的分析

藻胆蛋白属于胞内蛋白质, 要破碎海藻细胞的细胞壁、细胞膜, 才能使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来, 并注意保持其活性. 细胞破碎程度越高, 藻胆蛋白的得率和纯度也越高, 不同的细胞破碎方法提取效果不同. 因此, 采用何种细胞破碎技术是直接影响藻胆蛋白提取效率的关键因素之一.本实验以藻胆蛋白含量测定结果为指标, 对研磨法和反复冻融法的破壁效果进行比较, 结果显示研磨法能破碎80 %以上的细胞, 若将研磨法和反复冻融法结合起来, 先用研磨法破碎绝大多数的细胞,针对游离的细胞再用反复冻融法使其破碎, 能更加准确地测定细胞的胞内物质含量. 藻胆蛋白在受热或强光照射时易变性, 叶绿素受光照时容易氧化分解, 因此在提取过程中应避免光照并保持低温.

3.3　坛紫菜主要色素的应用前景展望

坛紫菜作为一种经济价值很高的红藻, 具有多种生物活性成分, 如紫菜的多糖具有降血脂、免疫调节、抗凝血等功能; 紫菜的β - 胡萝卜素能猝灭生物体内化学活性很高的自由基, 从而降低因自由基诱发的过氧化作用, 具有延缓衰老和抵抗癌症的作用. 而且坛紫菜除了其食用、药用、营养和提取活性物质等价值外, 不同色泽的坛紫菜在发展观赏业、提取色素和制成色泽鲜艳的食品等方面都具有重要的开发价值. 藻胆蛋白作为紫菜体内的捕光色素蛋白和胞内储存蛋白, 同样也具有重要的生理功能; 而叶绿素不仅与生长速度有很大关系, 并且干紫菜中叶绿素含量的多少跟感官评定紫菜优劣最为一致. 因此, 本研究能更加准确地测定藻胆蛋白和叶绿素a含量, 为紫菜优良品种的选育和应用提供依据. 本研究还初步探讨了藻胆蛋白和叶绿素a含量与培养环境的关系, 但是, 对于环境因素所引起的细胞在微观水平上的变化及生理机理, 还有待于进一步的研究.