蛋白质含量测定的常用方法
蛋白质含量测定方法一般来说，有以下五种：凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）。
表 五种蛋白质含量测定方法的比较
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方法 |
灵敏度 |
时间 |
原理 |
干扰物质 |
说明 |
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凯氏定氮法 （Kjedahl法） |
灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ |
费时 8～10小时 |
将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 |
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） |
用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 |
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双缩脲法（Biuret法） |
灵敏度低 1～20mg |
中速 20~30分钟 |
多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物 |
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 |
用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 |
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紫外吸收法 |
较为灵敏 50～100mg |
快速 5～10分钟 |
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 |
各种嘌吟和嘧啶； 各种核苷酸 |
用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 |
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Folin－酚试剂法（Lowry法） |
灵敏度高 ～5mg |
慢速 40～60 分钟 |
双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 |
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 |
耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 |
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考马斯亮蓝法(Bradford法) |
灵敏度最高 1～5mg |
快速 5～15分钟 |
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm |
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS |
最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 |
从以上表格中可以得出，不同的方法有不同的特点和优势，如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来，最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法)效率最高，无论是测定时间，灵敏度还是受干扰程度，都是比较占优势的。
下面，我们来重点介绍一下其中一种蛋白质含量测定方法--凯氏定氮法。
凯氏定氮法（Kjedahl法）
首先将浓硫酸倒入样品中，边倒边摇晃，以使浓硫酸与样品充分接触，然后加热试剂。如果你需要加快实验进度，可以加入CuSO4作催化剂，这样，实验的反应时间就会大大缩短。CH2COOH和H2SO4反应生成氨气，然后氨气又与H2SO4发生作用，固定了氮元素。这时我们得到了(NH4)2SO4的溶液，然后我们可以用NaOH去跟硫酸铵反应，通过计算NaOH的使用量，就可以计算出氮的含量。下面是整个定氮法中发生的化学反应。
CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
当我们得到氮的含量以后，我们就可以通过一定的计算，最终算出蛋白质的含量。
凯氏定氮法常用于有机化合物中的氮含量的测定，是蛋白质含量测定的经典方法，虽然在测试过程中，试剂用量很大，但是，不可否认，它所适用的样品范围之广，测试结果之精确，都是公认的。
