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凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其消化、蒸馏

来源: http://www.grainyq.com  类别:实用技术  更新时间:2012-07-02  阅读
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以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法,是国际上通用的标准方法,操作简单,测定结果重复性和重现性都很好,广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同,主要区别在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小,实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。凯氏定氮法整个测定过程分为消解、蒸馏、滴定三步。凯式定氮法包括消化炉蒸馏装置,它们的结合能够让实验尽可能的简单。  

要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度,认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项,就显得尤为重要。 

实验过程操作

1、主要试剂的配制

40%氢氧化钠:化学纯400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。

2%硼酸:分析纯20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。

0.05mol/L盐酸:分析纯4.2ml盐酸定容至1000ml,通过无水碳酸钠标定。

混合指示剂:把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l%

甲基红溶液1份混合而成.

2、实验过程注意事项

(1)样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。

固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g;半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL(约相当氮30mg~40mg)。若检测液体样品,结果以g/100mL表示。

样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。

(2)样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低,或者用滤纸包裹好一起投入消化,滤纸影响通过空白扣除。消化时应注意旋转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,加入数滴过氧化氢后,再继续加热消化至完全。

(3)消化时,不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时,注意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡,或硅消泡剂减少泡沫产生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。海能公司消解炉SH220或SH520能够很好的解决此问题。

(4)如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这样会形成硫酸氢钾,而不与氨作用。因此,当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时,要增加硫酸的量;加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点;催化剂硫酸铜在有机物全部消化后,溶液显清澈透明的蓝绿色,可用它来指示消化终点。此外,硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。过氧化氢,为氧化剂,有助于有机物消化,同时可以消除消化过程中的气泡现象。

(5)向蒸馏器瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀物,这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用,生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]2 ,加入氢氧化钠是否足量,常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知,当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色;当氢氧化钠量不足时就无黑色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色,所以有无氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。

(6)因蒸馏时反应室的压力大于大气压力,故可将氨带出。所以,蒸馏时,蒸气要发生均匀,充足,蒸馏中不得停火断气,否则,会发生倒吸。停止蒸馏时,由于反应室外层的压力突然降低,可使液体倒吸入反应室外层,所以,操作时,应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸一分钟后关掉热源。蒸馏是否完全,可用精密PH试纸测冷凝管口的冷凝液来测定,中性则说明已蒸馏完全。一般情况下建议使用半微量法,因为如果蒸馏失败的话,半微量法还可继续蒸馏,而常量法只好全部重来,费时费力。我们使用海能K9840经过多次蒸馏吸收实验达到理想效果。

(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿,可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

(8)吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸,过剩的酸液用0.01N碱液滴定,而以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,亦可免去用移液管,操作比较简便。另外,硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则氨吸收减弱,造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。

(9)在盐酸标准溶液的配制时,必须将基准无水碳酸钠于270-300℃灼烧至恒重后称取所须用量,否则也会影响蛋白质测定结果的准确性。盐酸标准溶液的浓度,常量法中取0.1M比较合适,半微量法中则在0.02~0.05M之间比较合适。

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